Le criblage à haut débit (High Throughput Screening) pour la recherche de médicaments nouveaux
Pourquoi le criblage à haut débit ?
La recherche de molécules actives par l’industrie pharmaceutique ne connaît pas de répit :
- un besoin sitôt satisfait en démasque d’autres, ainsi prolonger la vie d’un malade le confronte à des pathologies dérivées ;
- hasard ou nécessité, de nouveaux agents infectieux arrivent régulièrement sur le devant de la scène ;
- enfin le passage des médicaments brevetés dans le domaine public est une incitation puissante au renouvellement du portefeuille de produits.
Le criblage à haut débit consiste à passer dans un test biologique un nombre aussi élevé que possible de molécules différentes, en un temps raisonnable. Aujourd’hui « haut débit » signifie une molécule par seconde.
Les premiers criblages à haut débit
L’industrie pharmaceutique est entrée dans le haut débit au milieu des années quatre-vingt, avec le test de souches de micro-organismes prélevés au hasard pour tester des antibiotiques (25 000 par an à l’époque, chez le seul Rhône-Poulenc), et le test de molécules actives pour leur capacité à modifier l’activité enzymatique de protéines connues. Les tests enzymatiques et les tests de liaison à des récepteurs ont commencé à être robotisés à cette époque.
Robot de pipetage associé à un incubateur à carrousel pour le criblage sur neurones en culture.
Les années quatre-vingt-dix voient émerger les « chimiothèques », collections d’échantillons calibrés de molécules de synthèse, prêtes à l’emploi pour le criblage robotisé au format « 96 puits » (8 lignes x 12 colonnes). Les meilleures chimiothèques atteignent le million de molécules.
Les résultats, sans être nuls, n’ont pas été à la hauteur des espoirs. Il y a plusieurs raisons à cela :
- d’abord les chimiothèques, en particulier celles issues de la chimie combinatoire, (si grande soit-elle, une chimiothèque ne représente qu’une infime partie des possibles), peuvent n’avoir aucune intersection avec l’ensemble restreint des molécules se liant au récepteur (cible) choisi pour le criblage ;
- la deuxième raison est que pour les cibles déjà identifiées on dispose d’excellents ligands1, et qu’il s’est avéré bien plus difficile que prévu de qualifier de nouvelles cibles. Il y a loin d’une cible potentielle, telle qu’identifiée par la « génomique » à une cible qualifiée, dont les ligands, agonistes ou antagonistes, présenteront une activité pharmacologique intéressante.
Les chimiothèques orientées
Pour améliorer le rendement du criblage on a d’abord porté l’effort sur les chimiothèques « orientées », où la chance de trouver des molécules actives et exploitables est augmentée. Par exemple, en introduisant des motifs structuraux identifiés comme éléments de liaison aux protéines d’intérêt, en prêtant attention à la solubilité au nombre de sites donneurs ou accepteurs de liaisons hydrogènes, etc. Un regain d’intérêt a concerné les extraits végétaux naturels, riches en molécules dotées de capacité d’interaction avec les protéines ou les acides nucléiques.
Le criblage cellulaire de première génération
Le principal progrès des cinq dernières années est l’utilisation de cellules pour les opérations de screening. Certes on utilise depuis longtemps des micro-organismes pour la recherche d’antibiotiques. Ce qui est nouveau c’est la possibilité de faire exprimer n’importe quelle cible, humaine en particulier, dans une lignée cellulaire. Il est donc possible de remplacer les tests de liaison simples sur protéines purifiées, par des tests plus fonctionnels portant sur des protéines en situation. C’est spécialement important pour les protéines membranaires et transmembranaires comme les canaux ioniques. Si la cible est intracellulaire un test sur lignée écartera automatiquement les molécules incapables de pénétrer les cellules.
Avec l’introduction de marqueurs fluorescents (marqueurs chimiques ou marqueurs recombinés endogènes), pour pratiquement tous les cas de figure, les tests cellulaires ont envahi le domaine du criblage en trois ans (1999−2003). Miniaturisés et automatisés ils procèdent à la même cadence que les tests de liaison, plusieurs milliers de molécules/jour, avec une instrumentation de lecture inchangée. Le taux de coups au but (hits) s’en est trouvé considérablement amélioré.
Le criblage cellulaire de deuxième génération
On ne s’arrête pas en si bon chemin. Les lignées cellulaires ont leurs limites : la principale est qu’elles n’ont pas la différenciation des cellules que l’on vise. On ne peut pas les utiliser pour des tests de survie car elles sont altérées sur les voies de mort cellulaire programmée (apoptose)2.
Ainsi, Trophos, société spécialisée dans les maladies neuro-dégénératives, a choisi de reproduire sur des neurones en culture le processus de pathophysiologie. Si l’on veut sauver le neurone moteur dans l’amyotrophie spinale infantile, c’est un neurone moteur primaire, convenablement stressé, qui sert de support du criblage.
Dans ce cas, la cible n’est plus nécessairement une protéine identifiée : ce peut être un processus cellulaire-apoptose, expression d’un groupe de gènes, activation d’une cascade de phosphorylation3, translocation4 d’une protéine ou d’un élément subcellulaire, etc., pourvu que l’effet soit mesurable au travers d’un marqueur optique.
Concept nouveau, multicible, au sens moléculaire, qui accroît encore les chances d’un coup au but. Il est particulièrement avantageux d’opérer sur des cellules naturelles en transfection transitoire5, plutôt que sur des lignées, et nous l’avons fait pour des modèles cellulaires de maladie de Huntington et de maladie d’Alzheimer.
Il a fallu innover sur l’instrumentation et la méthodologie.
Pour s’adapter à des populations de cellules rares (motoneurones) ou minoritaires, avec des signaux faibles, dans un environnement de cellules accessoires, il faut opérer en mode « cytométrie », c’est-à-dire examiner les cellules une à une, éliminer celles qui n’ont pas les caractéristiques voulues et procéder aux analyses statistiques sur les autres. On ne connaissait jusqu’ici que le cytomètre en flux, adapté aux cellules circulantes (leucocytes), nous avons mis au point un cytomètre par analyse d’image (Flash Cytometer) qui opère sur tout type de cellule adhérente (la majorité). À raison d’une analyse de population par seconde (quelques milliers de cellules) la cadence est compatible avec le criblage à haut débit.
La méthodologie a été adaptée à une situation de fort taux de « hits » propre aux modèles cellulaires intégrés : par exemple lorsque l’on teste sur la survie de neurones, on s’expose à noter comme positives des molécules qui bloquent l’activité électrique, ou même la synthèse protéique, ce qui a toujours un effet positif sur la survie à court terme. Ces molécules sont écartées par des tests complémentaires simples.
Perspectives
La course au débit et aux grands nombres fait place aujourd’hui à une recherche de pertinence du test : à cet égard le criblage par cytométrie représente une avancée considérable, il permet de baser le criblage sur la cellule même qui fait l’objet du projet thérapeutique. Il permet aussi le criblage sur des populations cellulaires en interaction où l’on recherchera un effet (flux calcique par exemple) sur un type cellulaire, transmis par un autre type sur lequel agit la molécule chimique. Les exemples ne manquent pas : neurones-cellules musculaires, cellules gliales-neurones, etc.
Le modèle cellulaire ainsi conçu représente une miniaturisation de l’animal, bien plus qu’un simple support de cible. Dans les modèles cellulaires mis en œuvre dans notre laboratoire les molécules trouvées actives dans le test cytométrique se sont également trouvées actives sur les animaux. C’est un facteur essentiel pour accroître les chances de succès d’un essai sur l’homme.
1. Petite molécule qui présente une haute affinité pour un récepteur donné et qui pourrait être à l’origine du développement d’un médicament.
2. Fixation d’acide phosphorique sur un substrat, catalysée dans la cellule par des kinases.
3. Processus actif d’autodestruction par fragmentation de certaines cellules aboutissant à leur phagocytose. Cette mort cellulaire, contrairement à la nécrose, n’est pas consécutive à une agression mais génétiquement programmée.
4. Déplacement actif d’un compartiment de la cellule à un autre.
5. La transfection transitoire est assez difficile à expliquer : c’est l’introduction dans la cellule d’une construction d’ADN destinée à s’exprimer immédiatement mais non transmise à la descendance.
