Les tours de passe-passe des topoisomérases

Le contexte biologique

Le contexte biologique

Il y a cinquante ans, Crick et Wat­son décrivaient la struc­ture de la dou­ble hélice et fai­saient remar­quer que l’ex­is­tence des deux brins com­plé­men­taires per­me­t­tait de pro­pos­er un mécan­isme de répli­ca­tion de la molécule dans lequel il suff­i­sait de sépar­er les deux brins et de recopi­er cha­cun en for­mant son com­plé­men­taire pour obtenir enfin deux molécules d’ADN filles rigoureuse­ment iden­tiques à la molécule par­ente. Cette intu­ition devint une réal­ité dans les années 1970–1980 lorsque les enzymes chargées du recopi­age, les polyméras­es, ain­si que celles chargées de sépar­er les brins com­plé­men­taires, les héli­cas­es, furent iden­ti­fiées puis isolées.

La struc­ture de la dou­ble hélice implique que les deux brins d’ADN com­plé­men­taires s’en­tor­tillent l’un autour de l’autre. Par ailleurs, les molécules d’ADN sont très longues (~10 cm pour un chro­mo­some) et l’on compte un tour d’hélice tous les 3,4 nanomètres. En con­séquence, le nom­bre de tours impliqué est gigan­tesque. Or, le bon fonc­tion­nement du mécan­isme de dupli­ca­tion de l’ADN implique que tous les tours, jusqu’au dernier, soient débobinés afin de pou­voir sépar­er les deux molécules filles. Afin d’ac­com­mod­er cette con­trainte majeure et très déli­cate, on imag­i­nait sim­ple­ment que les molécules tour­naient au niveau de leurs extrémités. De plus, la com­plex­ité de ce prob­lème s’est encore accrue dans le cas des bac­téries : dans ces organ­ismes, l’ADN adopte la forme d’un anneau fer­mé par des liaisons chim­iques cova­lentes. En con­séquence, les deux brins de la dou­ble hélice sont topologique­ment insé­para­bles. Dix ans après la décou­verte de Crick et Wat­son, ce prob­lème a même poussé cer­tains à dire que la dou­ble hélice n’é­tait prob­a­ble­ment pas la bonne structure !

C’est James Wang qui dans les années soix­ante-dix appor­ta la solu­tion à l’énigme [1]. Il décou­vrit une nou­velle classe d’en­zyme, les topoi­soméras­es, qui sont capa­bles de chang­er la topolo­gie de la molécule d’ADN en effec­tu­ant une coupure tem­po­raire dans la molécule pour y faire pass­er soit un brin, soit les deux brins de la dou­ble hélice. Ce faisant, ces enzymes per­me­t­tent de relâch­er les con­traintes de tor­sion sur une molécule ou de désenchevêtr­er deux molécules entortillées.

La décou­verte des topoi­soméras­es a per­mis de résoudre le prob­lème des nœuds dans les molécules d’ADN. Cepen­dant, leur fonc­tion­nement a soulevé d’autres ques­tions : com­ment des enzymes mesurant quelques nanomètres peu­vent-elles relâch­er jusqu’au dernier tour d’en­tor­tille­ment des molécules qui s’é­ten­dent sur des dis­tances jusqu’à un mil­lion de fois plus grandes ? Com­ment ces enzymes déter­mi­nent-elles de quel côté de la brèche il faut trans­fér­er une molécule afin de défaire un nœud et non pas, au con­traire, en créer de nou­veaux ? Les répons­es à ces ques­tions nous man­quent encore à l’heure actuelle. Cer­tains de nos résul­tats sug­gèrent que ces enzymes recon­nais­sent l’an­gle for­mé par les molécules lors de leur croise­ment. En par­ti­c­uli­er, un type de topoi­somérase que l’on trou­ve chez les bac­téries se com­porte très dif­férem­ment selon l’an­gle de croise­ment des molécules Cepen­dant, les véri­fi­ca­tions expéri­men­tales de ces hypothès­es sont par­ti­c­ulière­ment déli­cates à réalis­er dans des expéri­ences faites en tube à essai. En effet, dans ce con­texte, comme les molécules d’ADN sont soumis­es au mou­ve­ment brown­ien, l’an­gle qu’elles adoptent lors de leur croise­ment est large­ment aléatoire.

Néan­moins, depuis quelques années, des expéri­ences peu­vent être réal­isées à l’échelle d’une seule molécule. Ces expéri­ences per­me­t­tent de con­trôler les paramètres physiques d’une molécule et d’im­pos­er, comme nous le décrivons ci-dessous, l’an­gle de croise­ment entre deux molécules.

La micromanipulation par pinces magnétiques

Ce sont les groupes de S. Chu et C. Bus­ta­mante qui ont réal­isé les pre­mières expéri­ences de micro­ma­nip­u­la­tion de molécules uniques [2]. Celles-ci se font à l’aide d’un micro­scope optique et dans le milieu naturel de la molécule d’ADN, c’est-à-dire de l’eau avec un peu de sel. Dans ces con­di­tions, l’ob­ser­va­tion directe de la molécule est impossible.

FIGURE 2

Principe de l’expérience de micromanipulation. L’observation se fait à l’aide d’un micro­scope optique placé sous l’échantillon. Bien que les molécules d’ADN soient invis­i­bles, les billes per­me­t­tent de matéri­alis­er leurs extrémités. L’échantillon est con­sti­tué par un tube de verre de sec­tion par­al­lélépipédique dans lequel nous avons intro­duit des molécules d’ADN qui s’accrochent à la paroi du tube de verre et à des micro­billes mag­né­tiques. Des aimants (dont les dimen­sions ne sont pas respec­tées sur ce sché­ma) sont placés audessus de l’échantillon, ils exer­cent une force de trac­tion ver­ti­cale d’autant plus grande que les aimants sont proches. En faisant tourn­er les aimants autour de l’axe ver­ti­cal, nous faisons tourn­er les billes sur elles-mêmes. Dans l’échantillon, toutes les billes ne sont pas for­cé­ment attachées par deux molécules mais celles qui le sont présen­tent un change­ment d’extension déce­lable lorsque les deux molécules sont amenées à se crois­er (voir fig­ure 3). Il est ain­si facile de choisir les billes attachées par deux molécules.

Par con­tre, en util­isant un “scotch molécu­laire” il est assez facile d’at­tach­er une bille de quelques microns à une extrémité de la molécule et de visu­alis­er ain­si ses mou­ve­ments. Mieux, on peut attach­er de façon ana­logue la sec­onde extrémité de la molécule à la paroi du récip­i­ent. En exerçant une force sur la bille, on peut ain­si étir­er la molécule d’ADN. Le “scotch molécu­laire” est un cou­ple de molécules de type “clef-ser­rure” : la clef est une petite molécule (de la bio­tine par exem­ple) qui pos­sède une affinité très impor­tante pour une molécule plus grosse qui en épouse la forme (de la strep­ta­vi­dine dans le cas de la bio­tine). La molécule d’ADN est pré­parée en attachant chim­ique­ment la bio­tine à une extrémité. Les billes mag­né­tiques sont recou­vertes de streptavidine.

En plaçant les molécules d’ADN ain­si pré­parées en présence des billes en solu­tion, celles-ci se cou­plent spon­tané­ment aux billes de façon qua­si irréversible. L’ac­crochage de la sec­onde extrémité de la molécule se fait par un deux­ième jeu clef-ser­rure (digox­igé­nine-antidigox­igé­nine). Comme l’ac­crochage des billes aux molécules d’ADN se fait par dif­fu­sion, rien n’empêche deux ou plusieurs molécules d’ADN de reli­er la bille à la sur­face du récip­i­ent. En pra­tique, nous ajus­tons la con­cen­tra­tion rel­a­tive des molécules aux billes pour que la plu­part de celles-ci soient reliées par une seule molécule d’ADN. (Les billes qui ne sont attachées à aucune molécule sont élim­inées par rinçage.) Cepen­dant, sta­tis­tique­ment un petit nom­bre de billes se trou­vent être attachées par deux molécules d’ADN, cette con­fig­u­ra­tion va nous per­me­t­tre de crois­er à volon­té deux molécules.

Au cours de leur mou­ve­ment brown­ien, les molécules d’eau bous­cu­lent l’ADN dans tous les sens et ten­dent à lui faire adopter la forme d’une pelote fluc­tu­ante. Il faut donc appli­quer une force pour étir­er la molécule ; ceci se fait en agis­sant sur la bille micrométrique qui localise une extrémité de la molécule. Il existe plusieurs moyens pour appli­quer cette force. D’abord, les pinces optiques, qui utilisent un fais­ceau laser con­vergeant qui attire la bille près de son point de focal­i­sa­tion. Ensuite, les pinces mag­né­tiques, basées sur l’u­til­i­sa­tion d’aimants qui attirent la bille con­tenant un matéri­au mag­né­tique. Cette sec­onde méthode per­met égale­ment de faire tourn­er la bille sim­ple­ment en faisant tourn­er les aimants.

Dans le cas des pinces mag­né­tiques, pour une posi­tion don­née des aimants par rap­port à la bille, la force appliquée est con­stante dans le domaine que peut explor­er la bille. Pour déter­min­er cette force, il suf­fit de mesur­er l’am­pleur du mou­ve­ment brown­ien de la bille. Pour les faibles forces ces mou­ve­ments sont impor­tants ; plus on rap­proche les aimants, plus la force de trac­tion aug­mente et plus l’am­pleur du mou­ve­ment brown­ien dimin­ue. La bille attachée à la molécule d’ADN sous l’ac­tion des aimants se com­porte comme un pen­d­ule inver­sé, la force mag­né­tique la tirant vers le haut.

En appli­quant le théorème de l’équipar­ti­tion, on mon­tre que F = l.k_BT/< x2 > [3] (où l est l’ex­ten­sion de la molécule, < x² > est l’am­pli­tude qua­dra­tique moyenne du mou­ve­ment brown­ien, k_B la con­stante de Boltz­mann et T la tem­péra­ture absolue). La force typ­ique qu’il faut appli­quer pour étir­er une molécule d’ADN est de l’or­dre de 1 pN (10-¹² N), mille fois plus faible que la force de rup­ture de l’ADN (~1 000 pN).

Pour mesur­er le mou­ve­ment brown­ien, nous avons écrit un pro­gramme de traite­ment d’im­ages vidéo qui suit la posi­tion hor­i­zon­tale de la bille en temps réel, avec une pré­ci­sion de quelques nanomètres. En analysant les motifs de dif­frac­tion de l’im­age de la bille obtenue en éclairage par­al­lèle, il est égale­ment pos­si­ble d’obtenir la posi­tion ver­ti­cale de la bille avec une pré­ci­sion com­pa­ra­ble. Cette mesure nous per­met ain­si de déter­min­er la dis­tance séparant la bille de la paroi du récipient.

Le vrillage d’une balançoire

FIGURE 3 — Tours de passe-passe moléculaire

Principe d’action de la topoi­somérase sur le croise­ment de deux molécules d’ADN. En faisant effectuer un tour à la bille avec les aimants, nous pou­vons pass­er d’une sit­u­a­tion où les molécules ne présen­tent pas de croise­ment (droite) à celle où elles se croisent (gauche). La topoi­somérase recon­naît alors le croise­ment, et en opérant l’action décrite dans la fig­ure 1, l’enzyme dénoue le croise­ment et ramène les deux molécules dans la sit­u­a­tion sans croise­ment (droite). Dès lors, la con­trainte étant relâchée, l’enzyme ne peut plus agir. Le change­ment de hau­teur entre les deux con­fig­u­ra­tions per­met de déter­min­er le moment où l’action de l’enzyme s’effectue. Par ailleurs, dans l’hypothèse où les points d’attache des molécules sont séparés par des dis­tances équiv­a­lentes, le change­ment relatif de hau­teur entre les deux con­fig­u­ra­tions est égal à (1 – cosq/2) où q est l’angle de croise­ment des deux molécules. Si nous ajou­tons main­tenant des topoi­soméras­es dans la solu­tion avec un peu d’ATP (la source d’énergie néces­saire à la plu­part des opéra­tions enzy­ma­tiques), il ne se passe rien si les deux molécules sont parallèles. Par con­tre, si nous créons un point de croise­ment en imp­ri­mant un tour à la bille, l’extension de la molécule dimin­ue pour les raisons décrites ci-dessus. Alors, une topoi­somérase va s’accrocher au croise­ment et le sup­primer, per­me­t­tant à l’extension de repren­dre sa valeur max­i­male de départ. On peut alors imprimer un nou­veau tour à la bille générant un nou­veau croise­ment que l’enzyme va s’empresser de dénouer, etc. Chaque événe­ment cor­re­spond à un seul cycle enzy­ma­tique d’autant plus facile à détecter que le change­ment d’extension cor­re­spond à une frac­tion de micron comme on peut le voir sur la fig­ure 4.

Il est assez facile de sélec­tion­ner les billes ancrées à la paroi par deux molécules : ces molécules sont typ­ique­ment séparées par une dis­tance com­pa­ra­ble au ray­on de la bille. En faisant tourn­er celle-ci d’un demi-tour dans un sens ou dans l’autre, les deux molécules sont amenées à se crois­er. Si la longueur des molécules est com­pa­ra­ble au diamètre de la bille, il se pro­duit alors un rac­cour­cisse­ment notable de la dis­tance séparant la bille à la paroi, comme on peut l’ob­serv­er en faisant vriller une bal­ançoire autour de son axe.

Cette vari­a­tion rapi­de d’ex­ten­sion sur un tour n’est vis­i­ble que sur des billes accrochées par deux molécules. Ces billes nous four­nissent un moyen sim­ple de crois­er deux molécules avec un angle don­né que nous éval­u­ons en mesurant le rac­cour­cisse­ment provo­qué par un demi-tour com­paré à la longueur des molécules d’ADN dans leur con­fig­u­ra­tion par­al­lèle. Évidem­ment, pour une longueur don­née de la molécule d’ADN, cet angle dépend de la dis­tance séparant les deux molécules que nous ne con­trôlons pas. Cepen­dant en allant à la pêche aux billes, on peut réalis­er un échan­til­lon­nage de dif­férents angles de croise­ment s’é­ta­lant de 50° à plus de 100° [4].

Comme illus­tré en fig­ure 5, le point de croise­ment de deux molécules chi­rales d’ADN for­mant un angle n’est pas le symétrique de la con­fig­u­ra­tion cor­re­spon­dant à l’an­gle — θ. Par con­tre, les sit­u­a­tions — θ et π — θ sont, elles, symétriques [6]. Dans notre expéri­ence, en tour­nant la bille d’un demi-tour dans le sens des aigu­illes d’une mon­tre nous obtenons un angle de croise­ment θ, en tour­nant dans l’autre sens, nous obtenons — θ. En employ­ant la rota­tion des aimants pour génér­er le sub­strat topologique (c’est-à-dire l’an­gle) voulu, il est aisé de mesur­er le temps mis par la topoi­somérase IV pour dénouer le croise­ment cor­re­spon­dant à θ et — θ. La valeur de l’an­gle θ est déter­minée à par­tir du change­ment de hau­teur de la bille et de la longueur des molécules.

Pour les petits angles de croise­ment (cor­re­spon­dant à des billes dont la hau­teur change peu en pas­sant de la con­fig­u­ra­tion molécules par­al­lèles à molécules croisées), nous obser­vons que le temps d’ac­tion moyen de la topoi­somérase IV est vingt fois plus long pour la con­fig­u­ra­tion à 50° que celle cor­re­spon­dant à — 50°. Pour les billes qui présen­tent une vari­a­tion de hau­teur impor­tante, l’an­gle de croise­ment approche 90° et peut même dépass­er cette valeur. Or comme nous l’avons expliqué la sit­u­a­tion de croise­ment à 90° est iden­tique à celle de croise­ment à — 90°. Ain­si nos expéri­ences mon­trent que pour un angle de θ = + 76° ou — 76° les temps moyens d’ac­tion ne dif­fèrent que de 10 %.

Puisque les molécules d’ADN sont ani­mées de fluc­tu­a­tions brown­i­ennes impor­tantes, leur angle de croise­ment présente en fait une dis­tri­b­u­tion et la valeur de l’an­gle de croise­ment dont nous avons par­lé est en fait la valeur moyenne. La largeur de cette dis­tri­b­u­tion dépend de la force de trac­tion appliquée aux molécules. Si la force est très grande, les molécules sont qua­si­ment rec­tilignes et la dis­tri­b­u­tion des angles est étroite ; aux faibles forces c’est l’in­verse. Dans notre expéri­ence, nous obser­vons bien que la sélec­tiv­ité angu­laire est ren­for­cée avec la force appliquée sur la bille.

La topoi­somérase IV est très habile lors de son tour de passe-passe molécu­laire, jamais nous ne l’avons sur­prise à lâch­er les brins coupés avant de les rec­oller (la bille se retrou­verait alors accrochée par une seule molécule). Un tel acci­dent serait dra­ma­tique au sein de nos chro­mo­somes : il con­duirait à une cas­sure dou­ble brin qui peut certes être réparée par des mécan­ismes cel­lu­laires adap­tés mais avec un taux d’échec très gênant.

FI​GURE 4

Sig­nal expéri­men­tal per­me­t­tant de voir l’action de la topoi­somérase : le graphique représente la dis­tance entre la bille et la paroi de verre. Lorsque celle-ci atteint la valeur de 3.45 microns, les deux molécules sont par­al­lèles. Quand les molécules se croisent la dis­tance se réduit à 2.75 microns. En présence de topoi­soméras­es dans la solu­tion on n’observe aucun change­ment de longueur lorsque les molécules sont par­al­lèles. Par con­tre chaque fois que l’on fait faire un tour aux aimants, dans un pre­mier temps, la bille se rap­proche de la paroi. Au moment où l’enzyme dénoue le croise­ment, on observe une remon­tée bru­tale de l’extension. Sur cet enreg­istrement, nous avons répété l’opération trois fois, à chaque fois l’enzyme a agi, cepen­dant elle l’a fait après un temps très variable. Le temps mis par l’enzyme pour libér­er le croise­ment après sa for­ma­tion cor­re­spond au temps de dif­fu­sion de l’enzyme pour trou­ver le point de croise­ment et au temps de fix­a­tion sur ce croise­ment. Il dépend évidem­ment de la con­cen­tra­tion d’enzyme ; mais d’un cycle au suiv­ant ce temps est une vari­able aléa­toire présen­tant une dis­tri­b­u­tion sta­tis­tique de Pois­son avec un temps car­ac­téris­tique t. Pour une con­cen­tra­tion enzy­ma­tique de l’ordre du nano-molaire, t est typ­ique­ment de quelques sec­on­des. Si nous tournons la bille de plusieurs tours rapi­de­ment, après un temps d’attente, une enzyme déjà sur place enchaîne une série de cycles avec une cadence de 2 ou 3 à la sec­onde [5].

Conclusion

FIGURE 5 — Les topoi­soméras­es recon­nais­sent l’angle de croise­ment des molécules

Symétrie angu­laire impliquée dans le croise­ment de deux molécules d’ADN. La sit­u­a­tion cor­re­spon­dant à l’angle ‑q (au cen­tre) est dif­férente de la sit­u­a­tion θ (à gauche), en effet ces deux con­fig­u­ra­tions découlent de la symétrie miroir (c’est une sit­u­a­tion chi­rale), par con­tre la sit­u­a­tion cor­re­spon­dant à l’angle -θ (au cen­tre) est équiv­a­lente à π — θ (à droite). Notons que pour θ = 90 les dif­férentes con­fig­u­ra­tions sont identiques.

Nous avons dévelop­pé des tech­niques de micro­ma­nip­u­la­tion de molécules uniques. Ces tech­niques nous ont per­mis de met­tre en évi­dence les mécan­ismes pré­cis qu’u­tilisent cer­taines enzymes pour dépli­er et réduire les ten­sions dans les molécules d’ADN.

Il s’ag­it d’un sujet de recherche très act­if actuelle­ment et plusieurs groupes de recherche ont obtenu des résul­tats remar­quables sur les moteurs molécu­laires, les polyméras­es, les héli­cas­es, etc. Ces résul­tats vien­nent naturelle­ment com­pléter ceux obtenus en tube à essai. Ils démon­trent, s’il était néces­saire, que ces enzymes sont de mag­nifiques machines capa­bles de tra­vailler avec une remar­quable pré­ci­sion dans un envi­ron­nement agité par le mou­ve­ment brown­ien. Les topoi­soméras­es sont pour le moins des enzymes extra­or­di­naires du fait qu’en bien des points elles sur­passent ce que nous savons faire à l’échelle macroscopique.

Ain­si il nous reste encore à com­pren­dre com­ment ces machines de taille nanométrique dénouent fidèle­ment des molécules mille fois plus grandes qu’elles.

Remer­ciements
Les expéri­ences décrites ici n’auraient pas été pos­si­ble sans l’aide de J.-F. ALLEMAND, O. SALEH, H. YOKOTA, T. LIONNET, M. DUGUET et le sup­port financier de l’ENS, du CNRS, des uni­ver­sités Paris VI et VII, de la CEE et de l’ARC.

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